quinta-feira, 22 de outubro de 2020

2° Ano E Biologia Profa Solange

Período para entrega: Até 28/10/2020

4° Bimestre: Unidade Temática: DNA- Tecnologias de Manipulação do DNA/ Biotecnologia

Instruções:

1- Assistir a vídeo aula (Khan Academy), link disponibilizado abaixo.

2- Fazer a Leitura e Interpretação de Texto.

3- Responder a atividade: Exercícios de Aprendizagem.

4- Postar no Blogger e enviar para o e-mail da professora: solangestandbyme@gmail.com

https://youtu.be/EDF_T0t7gN0

Introdução à biotecnologia

O que é biotecnologia. Visão geral da tecnologia do DNA. Questões éticas em biotecnologia.

Pontos Principais:

Biotecnologia é o uso de um organismo, componente do organismo ou qualquer outro sistema biológico para fazer um produto ou processo.
Muitas formas da biotecnologia moderna envolvem a tecnologia do DNA.
A tecnologia do DNA é o sequenciamento, análise e corte e colagem do DNA.
As formas típicas de tecnologia do DNA incluem o sequenciamento de DNA, reação em cadeia da polimerase, clonagem de DNA e eletroforese em gel.
As invenções da biotecnologia podem levantar novas preocupações práticas e questões éticas que devem ser discutidas com a participação de toda a sociedade.

Introdução

O que lhe vem à mente quando você ouve a palavra "biotecnologia"? Talvez algumas notícias que você tenha visto, tais como a ovelha clonada Dolly, organismos geneticamente modificados, ou terapia gênica.

Se foi nisso que pensou, você está absolutamente certo: todos são exemplos de biotecnologia. E quanto à fabricação de cerveja, cultivares e o antibiótico penicilina? Esses processos e produtos – alguns existentes há milhares de anos – também são exemplos de biotecnologia.

Neste artigo, examinaremos primeiro a definição de biotecnologia e como ela abrange diversos usos dos organismos (e moléculas ou sistemas derivados dos organismos) para gerar produtos úteis. Depois, daremos uma olhada mais profunda na tecnologia do DNA, técnicas de manipulação e sequenciamento de DNA. A tecnologia do DNA é fundamental para as diversas formas modernas da biotecnologia.

O que é biotecnologia?

Biotecnologia é o uso de um organismo, componente de um organismo ou qualquer outro sistema biológico para fazer um produto ou processo para um uso específico.

Esta definição é muito ampla e, como mencionado acima, pode incluir tanto técnicas laboratoriais de ponta, técnicas agrícolas tradicionais e técnicas culinárias praticadas há centenas de anos. Vejamos três exemplos de biotecnologia e como eles se encaixam na definição:

Fabricação de cerveja. Na fabricação de cerveja, minúsculos fungos (leveduras) são introduzidos em uma solução de açúcar de cevada maltada, que é vorazmente metabolizada por eles através de um processo chamado fermentação. O subproduto da fermentação é o álcool encontrado na cerveja. Aqui, vemos um organismo – a levedura – sendo usado para fazer um produto para o consumo humano.
Penicillina. O antibiótico penicilina é gerado por certos fungos. Para obter as pequenas quantidades de penicilina utilizadas nos primeiros ensaios clínicos, pesquisadores tiveram que cultivar quase 500 litros de "caldo de fungo" por semanastart superscript, 1, end superscript. O processo foi então aperfeiçoado para a produção industrial, com o uso de cepas de fungos mais produtivos e melhores condições de cultura para aumentar o rendimentosquared. Aqui, vemos um organismo (fungo), sendo usado para fazer um produto de uso humano – neste caso, um antibiótico para tratar infecções bacterianas.

Terapia gênica A terapia gênica é uma técnica emergente usada para tratar doenças genéticas causadas por um gene defeituoso. Ela funciona fornecendo às células do corpo o gene do DNA "deficiente" . Por exemplo, na doença genética fibrose cística, o gene não possui a capacidade de produzir canais de íons cloreto nos pulmões. Em um recente experimento clínico de terapia gênica, uma cópia do gene funcional foi inserida em uma molécula de DNA circular chamada plasmídeo que foi então fornecida às células pulmonares dos pacientes em esferas de lipídios (na forma de um spray)cubed.
Nesse exemplo, componentes biológicos de fontes diferentes (gene humano, plasmídeo proveniente de bactéria) foram combinados para fazer um novo produto que ajudou a manter a função pulmonar dos pacientes com fibrose cística.

Como mostram esses exemplos, a biotecnologia é usada na produção de produtos encontrados na vida cotidiana, tais como o álcool e a penicilina. Ela também pode ser usada para desenvolver novos tratamentos médicos, tais como a terapia gênica para tratamento da fibrose cística. A biotecnologia tem outras aplicações em áreas como a produção de alimentos e a remediação (limpeza) da poluição ambiental.

O que é tecnologia do DNA?

Muitos exemplos da biotecnologia moderna dependem da capacidade de analisar, manipular, cortar e colar pedaços do DNA. Ocasionalmente, as manobras de sequenciamento e manipulação de DNA são chamadas de tecnologia do DNAstart superscript, 4, end superscript. Por exemplo, no experimento da terapia gênica para a fibrose cística os pesquisadores usaram técnicas de manipulação de DNA para inserir o gene do canal de cloreto em uma parte do DNA transportador (um vetor) que permitiu a expressão gênica nas células pulmonares humanas.

A tecnologia do DNA é importante para a biologia geral e aplicada (prática). Por exemplo, uma técnica usada para fazer muitas cópias de uma sequência de DNA chamada reação em cadeia da polimerase (PCR) é usada em muitos testes de diagnóstico médico e aplicações forenses, bem como em pesquisas de laboratório geral.

Exemplos de tecnologia do DNA

Vejamos alguns exemplos de técnicas de análise e manipulação de DNA comumente usadas na biologia molecular moderna. Você pode usar os links abaixo para encontrar informações mais detalhadas sobre estas técnicas.

Clonagem do DNA. Na clonagem do DNA, os pesquisadores "clonam" – fazem muitas cópias do fragmento de DNA de interesse, tal como um gene. Em muitos casos, a clonagem do DNA envolve a inserção do gene de interesse em uma molécula de DNA circular chamada plasmídeo. O plasmídeo pode ser replicado nas bactérias, fazendo muitas cópias do gene de interesse. Em alguns casos, o gene é expresso também nas bactérias pela formação de uma proteína (por exemplo, a insulina usada pelos diabéticos).
Inserção de um gene no plasmídeo.
Reação em cadeia da polimerase (PCR). A reação em cadeia da polimerase é a técnica de manipulação do DNA mais amplamente utilizada, com aplicações em quase todas as áreas da biologia moderna. As reações da PCR produzem várias cópias da sequência de DNA de interesse, a partir da sequência de um DNA modelo. Essa técnica pode ser usada para fazer muitas cópias de um DNA que está presente em pequenas quantidades (por exemplo, uma gotícula de sangue na cena do crime).
Eletroforese em gel. A eletroforese em gel é uma técnica usada para visualizar os fragmentos de DNA (exame direto). Por exemplo, os pesquisadores podem analisar os resultados da PCR examinando os fragmentos de DNA que ela produz na reação em um gel. A eletroforese em gel separa os fragmentos de DNA com base em seu tamanho, em seguida os fragmentos são pigmentados com um corante que possibilita a visualização pelo pesquisador.
Os fragmentos de DNA migram pelo gel do eletrodo negativo para o positivo.
Depois de corrido o gel, os fragmentos são separados por tamanho, com os menores mais perto da parte inferior (eletrodo positivo) e os maiores perto do topo (eletrodo negativo).
Adaptado do diagrama de Reece et al.start superscript, 5, end superscript
Sequenciamento de DNA. O sequenciamento de DNA consiste em determinar a sequência das bases dos nucleotídeos (As, Ts, Cs e Gs) na molécula de DNA. Em alguns casos, apenas um fragmento de DNA é sequenciado por vez, enquanto em outros casos muitos fragmentos de DNA (como um genoma inteiro) podem ser sequenciados conjuntamente.

SAIBA MAIS:

O genoma é todo o DNA de um organismo.

Em eucariontes, os quais possuem um núcleo celular para conter o seu DNA, a palavra genoma é normalmente usada para se referir ao genoma nuclear (DNA encontrado no núcleo), o que exclui o DNA encontrado nas organelas tais como os cloroplastos ou mitocôndrias.

Veja nos links como essas técnicas funcionam mais detalhadamente. Veja também exemplos de uso das técnicas em pesquisa, medicina e outras aplicações práticas.

Biotecnologia e novas questões éticas

A biotecnologia tem potencial para trazer benefícios às pessoas e à sociedade, mas também pode ter efeitos negativos ou consequências não intencionais. Isto é verdade em todas as formas de tecnologia, não só na biotecnologia. Contudo, a biotecnologia pode oferecer tipos de benefícios diferentes, apresentando tipos de dilemas diferentes das outras formas de tecnologia.

É importante que as inovações biotecnológicas (assim como outras inovações tecnológicas) sejam cuidadosamente testadas e analisadas antes de serem liberadas para uso geral. Os ensaios clínicos e a regulamentação governamental ajudam a garantir que os produtos biotecnológicos colocados no mercado sejam seguros e eficazes. No entanto, às vezes surgem novas informações que obrigam as empresas e agências governamentais a reconsiderar a segurança ou utilidade de uma inovação. É o caso quando uma determinada medicação é retirada do mercado.

Ademais, as inovações biotecnológicas podem levantar novas questões éticas sobre se utilizar ou não da informação, das técnicas e do conhecimento.

Algumas delas dizem respeito à privacidade e não discriminação. Por exemplo, sua companhia de seguro de saúde deveria lhe cobrar mais se você tivesse uma variante de gene que o tornasse propenso a desenvolver alguma doença? Como você se sentiria se sua escola ou empregador tivesse acesso ao seu genoma?
Outras questões são relativas a segurança, efeitos na saúde e impactos ecológicos das biotecnologias. Por exemplo, cultivares geneticamente modificados para produzir seu próprio inseticida reduzem a necessidade de pulverização química, mas também suscitam preocupações caso as plantas escapem para a vida selvagem ou cruzem com espécies locais (potencialmente causando consequências ecológicas não intencionais).
A biotecnologia pode proporcionar conhecimentos que criam dilemas difíceis para os indivíduos. Por exemplo, um casal descobre no teste pré-natal que seu feto tem uma doença genética. Ou ainda, por curiosidade uma pessoa tem o seu genoma sequenciado e descobre que vai desenvolver uma doença genética incurável tardia, tal como a doença de Huntington.

A pesquisa científica e desenvolvimento podem disponibilizar novas informações, técnicas e conhecimentos. No entanto, a ciência sozinha não pode responder a perguntas sobre como essas técnicas devem ou não ser usadas. É importante que todos os membros da sociedade sejam ouvidos no debate sobre como as invenções e produtos da biotecnologia podem afetar nossa vida cotidiana.

Eduque-se e compartilhe sua opinião

Compreender a biologia básica por trás de qualquer forma de biotecnologia é o primeiro passo importante para julgar seus benefícios e possíveis riscos. As informações desta seção lhe ajudarão a iniciar a montagem do seu conjunto de ferramentas para compreender e avaliar as novas invenções da biotecnologia.

Se você está curioso sobre algum tipo específico de biotecnologia ou preocupado com suas possíveis consequências, uma ótima ideia é pesquisar por conta própria. Procure em fontes confiáveis e não tendenciosas. Se houver controvérsia. tente entender as opiniões dos dois lados. Certifique-se de que você compreende a ciência por trás da invenção, o que se sabe (e não se sabe) sobre ela e quais são os prós e contras. Assim, você poderá formar uma opinião bem embasada e ponderada sobre como a tecnologia deve ser usada ou não.

Referências:

Este artigo está autorizado sob licença CC BY-NC-SA 4.0.

Referências:

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Visão geral: Clonagem de DNA

Definição, finalidade e os passos básicos da clonagem do DNA.

Pontos Principais:

Clonagem de DNA é uma técnica da biologia molecular para fazer muitas cópias idênticas de um pedaço de DNA, tal como um gene.
Num experimento típico de clonagem, um gene alvo é inserido num pedaço circular de DNA chamado do plasmídeo.
O plasmídeo é introduzido em bactérias através de um processo chamado transformação, e bactérias portadoras do plasmídeo são selecionadas utilizando-se antibióticos.
As bactérias com o plasmídeo correto são utilizadas para produzirem mais DNA do plasmídeo ou, em alguns casos, induzidas a expressar o gene e produzir proteína.

Introdução

Quando você ouve a palavra “clonagem,” você pode pensar na clonagem de um organismo inteiro, como a ovelha Dolly. Porém, o significado de clonar alguma coisa é fazer uma cópia geneticamente exata dela. Num laboratório de genética molecular, o que é clonado com maior frequência é um gene ou um pequeno pedaço de DNA.

Se sua amiga bióloga molecular disser que sua "clonagem" não está funcionando, ela quase certamente estará falando acerca da cópia de pedaços de DNA, não de estar fazendo a próxima Dolly!

Visão geral da clonagem de DNA

Clonagem de DNA é o processo de fazer várias cópias idênticas de um pedaço específico de DNA. Num procedimento típico de clonagem de DNA, o gene ou outro fragmento de DNA de interesse (talvez um gene para uma proteína humana de interesse médico) é primeiramente inserido numa peça circular de DNA chamada plasmídeo. A inserção é feita utilizando-se enzimas que “cortam e colam” DNA, e produz uma molécula de DNA recombinante, ou seja, DNA montado a partir de fragmentos de várias fontes.

Em seguida o plasmídeo recombinante é introduzido em bactérias. As bactérias contendo plasmídeo são selecionadas e cultivadas. Conforme elas se reproduzem, replicam o plasmídeo e o transmitem para seus descendentes, produzindo cópias do DNA que ele contém.

Qual a finalidade de produzir várias cópias de uma sequência de DNA num plasmídeo? Em alguns casos, precisamos de muitas cópias de DNA para realizar experimentos ou construir novos plasmídeos. Em outros, o pedaço de DNA codifica uma proteína útil, e as bactérias são usadas como "fábricas" para produção dessa proteína. Por exemplo, o gene da insulina humana é expresso em bactérias E. coli para produzir a insulina usada pelos diabéticos.

SAIBA MAIS:

Talvez você saiba, se você tiver amigos ou familiares diabéticos, que o hormônio insulina desempenha um papel importante na saúde humana. No corpo da pessoa saudável, a insulina é produzida no pâncreas. Ela viaja através da corrente sanguínea e liga-se às células do corpo, permitindo-lhes absorver o açúcar glicose.

Numa pessoa com diabetes tipo I, as células do pâncreas que produzem insulina são danificadas ou destruídas. Pessoas com diabetes tipo I precisam injetar regularmente insulina de outra fonte para evitar níveis perigosamente elevados de açúcar no sangue (e para permitir a entrada do açúcar nas células do corpo, como combustível).

Por muitos anos, todos a insulina usada pelos diabéticos tipo I veio dos pâncreas de porcos e vacas que eram abatidos para a produção de carne. A molécula de insulina é semelhante entre os seres humanos, porcos e vacas, então a insulina de porco ou vaca pode substituir a insulina humana nos corpos dos diabéticos tipo I.

Na década de 1980, os cientistas começaram a desenvolver novas técnicas de produção de insulina humana utilizando bactérias Escherichia coli (E. coli). Eles basicamente transformaram as bactérias em pequenas fábricas de insulina. Essa insulina recombinante, ou insulina produzida pela combinação de DNA de várias fontes (humanas e bactérias), atualmente é o tratamento básico usado para diabéticos tipo I.

Etapas da clonagem do DNA

A clonagem do DNA é utilizada para várias finalidades.Como exemplo, vejamos como a clonagem do DNA pode ser utilizada para sintetizar uma proteína (como a insulina humana) nas bactérias. As etapas básicas são:

Cortar e abrir o plasmídeo e "inserir" o gene. Esse processo baseia-se em enzimas de restrição (que cortam o DNA) e na DNA ligase (que une/cola o DNA).
Inserir o plasmídeo na bactéria. Utilizar a seleção por antibiótico para identificar as bactérias que pegaram o plasmídeo.
Cultivar lotes de bactérias portadoras de plasmídeo e usá-las como "fábricas" para fazer a proteína. Colher a proteína das bactérias e purificá-la.

Vamos dar uma olhada mais detalhada em cada etapa.

1. Cortando e colando DNA

Como pedaços de DNA de diferentes fontes podem ser unidos? Um método comum utiliza dois tipos de enzimas: enzimas de restrição e DNA ligase.

Um enzima de restrição é uma enzima cortadora de DNA que reconhece uma sequência alvo específica e corta o DNA em dois pedaços neste sítio ou próximo a ele. Muitas enzimas de restrição produzem extremidades cortadas com saliências curtas de fita simples. Se duas moléculas tiverem saliências correspondentes, elas podem parear bases e permanecer juntas. Contudo, elas não irão se combinar para formar uma molécula de DNA intacta até que sejam unidas pelo DNA ligase, que sela as lacunas do eixo do DNA.

SAIBA MAIS:

Nossa meta na clonagem é inserir um gene alvo (p.e., para insulina humana) num plasmídeo. Usando uma enzima de restrição cuidadosamente escolhida, digerimos:

O plasmídeo, que tem um único local de corte
O fragmento do gene alvo, que tem um sítio de restrição (de corte) próximo a cada extremidade

Então, combinamos os fragmentos com DNA ligase, que os une para fazer um plasmídeo recombinante contendo o gene.

2. Transformação e seleção bacteriana

Os plasmídeos e outros DNA podem ser introduzidos nas bactérias, como as inofensivas E. coli utilizadas em laboratório, num processo chamado transformação. Durante a transformação, é dado um choque (por exposição a alta temperatura, por exemplo) a células bacterianas especialmente preparadas que as encoraja a incorporar DNA estranho.

SAIBA MAIS:

Ótima pergunta! Curiosamente, ninguém parece ser certeza total da resposta, apesar de a transformação pelo choque de calor ser uma técnica muito comum em biologia molecular. Em geral, acredita-se que o choque de calor altera a fluidez da membrana e/ou faz com que formem-se poros (buracos), tornando mais fácil o DNA atravessar e entrar na célulastart superscript, 1, end superscript.

Um plasmídeo geralmente tem um gene de resistência aos antibióticos, que permite que as bactérias sobrevivam na presença de um antibiótico específico. Assim, as bactérias portadoras de plasmídeo podem ser selecionadas em placas com nutrientes contendo o antibiótico. As bactérias sem plasmídeo morrerão, enquanto bactérias portadoras de plasmídeo podem viver e reproduzir-se. Cada bactéria sobrevivente dará origem a um grupo pequeno, como um ponto, ou colônia, de bactérias idênticas em que todas carregam o mesmo plasmídeo.

Nem todas as colônias irão necessariamente conter o plasmídeo certo. Isso acontece porque, durante uma ligação, fragmentos de DNA nem sempre ficam "colados" exatamente da maneira que queremos. Em vez disso, devemos coletar o DNA de várias colonias e ver se cada uma contém o plasmídeo certo. Métodos como digestão por enzima de restrição e PCR/RCP são comumente usados para checar os plasmídeos.

3. Produção de proteína

Uma vez que encontramos uma colonia de bactérias com o plasmídeo certo, podemos cultivar uma grande cultura de bactérias portadoras do plasmídeo. Nesse momento, damos às bactérias um sinal químico que as instrui a produzir a proteína alvo.

As bactérias servem como mini "fábricas," produzindo grandes quantidades de proteína. Por exemplo, se nosso plasmídeo continha o gene da insulina humana, as bactérias começariam a transcrição do gene e a tradução do RNAm para produzir muitas moléculas da proteína insulina humana.

SAIBA MAIS:

Os seres humanos e as bactérias compartilham o mesmo código genético, significando que um gene humano pode ser transcrito e traduzido nas bactérias.

No entanto, para um gene humano ser expresso em bactérias, ele deve ter uma modificação importante. Especificamente, ele não deve ter íntrons. Íntrons são sequências intermediárias, encontradas em muitos genes humanos, e eles são removidos dos transcritos de RNA eucarióticos por splicing para fazer um RNAm maduro. As bactérias não têm íntrons e não podem emendar transcritos de RNA.

Como podemos conseguir uma versão de um gene humano com os íntrons removidos? Uma versão sem íntrons de um gene humano pode ser feita de RNAm que codifica o gene, utilizando a enzima transcriptase reversa. A transcriptase reversa sintetiza uma fita de DNA usando um segmento de RNAm como um modelo. Depois de uma etapa adicional para o DNA de dupla-hélice, é produzida uma versão sem íntrons do gene (chamado de chamada um DNAc).

Uma vez que a proteína tenha sido produzida, as células bacterianas podem ser abertas para liberá-la. Existem muitas outras proteínas e macromoléculas flutuando nas bactérias além da proteína alvo (por exemplo, a insulina). Devido a isso, a proteína alvo deve ser purificada, ou separada dos outros conteúdos das células por técnicas bioquímicas. A proteína purificada pode ser usada para experimentos ou, no caso de insulina, administrada aos pacientes.

SAIBA MAIS:

Bem... sim e não. A insulina recombinante feita por empresas farmacêuticas é na verdade gerada nas bactérias, e é expressa de um plasmídeo portador de um gene de insulina humano modificado. A insulina feita pelas bactérias é purificada usando-se uma coluna de purificação.

No entanto, produzir insulina biologicamente ativa requer algumas etapas adicionais. A insulina é feita como uma cadeia única de polipeptídeos. No entanto, ligações dissulfeto devem se formar dentro da cadeia, e parte dela deve ser cortada para formar duas cadeias separadas (mantidas juntos apenas pelas ligações de dissulfeto). Só então é que a insulina estrá biologicamente ativa, isto é, será capaz de agir como um hormônio no corpo do paciente.

A produção de insulina que pode ser usada por diabéticos exige que estas etapas adicionais sejam incorporadas ao procedimento de purificação de proteínas, para que a proteína insulina tome sua forma tridimensional correta.

Usos da clonagem de DNA

As moléculas de DNA construídas a partir de técnicas de clonagem são utilizadas para vários propósitos em biologia molecular. Uma curta lista de exemplos inclui:

Biofarmacêuticos. A clonagem do DNA pode ser usada para produzir proteínas humanas com aplicações biomédicas, como a insulina mencionada acima. Outros exemplos de proteínas recombinantes incluem o hormônio do crescimento humano, que é ministrado a pacientes incapazes de sintetizá-lo, e o ativador de plasminogênio tecidual (tPA/ APt), que é usado para tratar derrames e prevenir coágulos sanguíneos. Proteínas recombinantes como estas. frequentemente são produzidas em bactérias.
Terapia genética. Em algumas desordens genéticas, os pacientes não possuem a forma funcional de um gene particular. A terapia genética tenta fornecer uma cópia normal do gene para as células do corpo do paciente. Por exemplo, a clonagem do DNA foi usada para construir plasmídeos com uma versão normal do gene que é não funcional na fibrose cística. Quando os plasmídeos foram liberados nos pulmões dos pacientes com fibrose cística, a função pulmonar deteriorou menos rapidamentesquared.
Análise genética. Em laboratórios de pesquisa básica , os biólogos geralmente usam a clonagem de DNA para construir versões artificiais, recombinantes dos genes que os ajudam a compreender como é a função normal dos genes num organismo.

SAIBA MAIS:

Por exemplo, pesquisadores estudando neurônios em moscas de fruta podem usar clonagem do DNA para construção de um gene repórter para um gene neural. Nessa construção, a região reguladora (promotor) do gene pode ser colada na frente de um gene que codifica uma proteína fluorescente. Quando transferido para uma mosca, o "gene repórter" seria expresso nos mesmos neurônios como o gene neural em si, fazendo esses neurônios brilharem (fluorescerem) sob a luz UV.

Estes são apenas alguns exemplos de como a clonagem de DNA é usada atualmente na biologia. A clonagem de DNA é uma técnica muito comum usada numa enorme variedade de aplicações de biologia molecular.

Referências:

Este artigo está autorizado sob licença CC BY-NC-SA 4.0.

Referências:

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Outras referências:

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Wilkin, D. (2016, March 23). Gene cloning - advanced. In CK-12 biology advanced concepts. Disponível em http://www.ck12.org/book/CK-12-Biology-Advanced-Concepts/section/9.2/.

Enzimas de restrição e DNA ligase

Digestão por restrição. Extremidades adesivas e coesivas. Reações de ligação.

Pontos Principais:

Enzimas de restrição são enzimas que cortam o DNA. Cada enzima reconhece um ou mais sequências alvo e corta o DNA nestas sequências ou perto delas.
Muitas enzimas de restrição fazem cortes escalonados, produzindo terminações com DNA fita simples. No entanto, algumas produzem extremidades rombas.
DNA ligase é uma enzima de adesão de DNA. Se dois pedaços de DNA tiverem terminações complementares, a ligase pode ligá-las para formar uma molécula de DNA única e contínua.
Na clonagem de DNA, enzimas de restrição e DNA ligases são utilizadas para inserir genes e outras frações de DNA em plasmídeos

Como cortar e colar DNA?

Na clonagem de DNA, pesquisadores fazem muitas cópias de um pedaço de DNA, tais como um gene. Em muitos casos, a clonagem envolve a inserção do gene em um pedaço de DNA circular chamado de plasmídeo, que pode ser copiado em bactérias.

Como podem pedaços de DNA de diferentes fontes (tais como um gene humano e um plasmídeo bacteriano) serem unidos para formar uma única molécula de DNA? Um método comum baseia-se em enzimas de restrição e DNA ligase.

Uma enzima de restrição é uma enzima que corta DNA que reconhece locais específicos no DNA. Muitas enzimas de restrição fazem cortes escalonados no local de seus sítios de reconhecimento ou perto deles, produzindo terminações de fita simples.
Se duas moléculas de DNA têm terminações que se correspondem, elas podem ser unidas pela enzima DNA ligase. A DNA ligase sela o vão entre as moléculas, formando um único pedaço de DNA.

Enzimas de restrição e DNA ligase são frequentemente usadas para inserir genes e outros pedaços de DNA em plasmídeos durante a clonagem de DNA.

Enzimas de restrição

Enzimas de restrição são encontradas em bactérias (e outros procariontes). Elas reconhecem e se ligam a sequências específicas de DNA, chamadas sítios de restrição. Cada enzima de restrição reconhece apenas um ou alguns sítios de restrição. Quando ela encontra suas sequências alvo, a enzima de restrição fará um corte na dupla hélice da molécula de DNA. Normalmente, o corte é no sítio de restrição ou próximo a ele e ocorre em um padrão arrumado, previsível.

SAIBA MAIS:

Acredita-se que as enzimas de restrição evoluíram como um mecanismo de defesa, permitindo que as bactérias cortem os DNAs estranhos que são potencialmente prejudiciais (por exemplo, o DNA dos vírus infectantes de bactérias).

Como um exemplo de como uma enzima de restrição reconhece e corta uma sequência de DNA, vamos considerar Eco RI, uma enzima de restrição comum usada em laboratórios. Eco RI corta no seguinte sítio:

Quando EcoRI reconhece e corta este sítio, ela sempre faz isso em uma padrão muito específico que produz extremidades com DNA fita simples.

Se outro pedaço de DNA tiver terminação correspondente (por exemplo, porque ele também foi cortado pela EcoRI), as terminações podem se juntar por pareamento de bases complementares. Por esta razão, diz-se que enzimas que deixam terminações de fita única produzem extremidades pegajosas . Extremidades pegajosas são úteis em clonagem porque seguram dois pedaços de DNA que podem ser ligados pela DNA ligase.

Nem todas as enzimas de restrição produzem extremidades adesivas. Algumas são "cortadoras bruscas" que cortam no meio de uma sequência alvo e não deixam terminação. A enzima de restrição SmaI é um exemplo de enzima que faz cortes bruscos:

Fragmentos com corte perpendicular, sem terminações de fita única, podem ser unidos um ao outro pela DNA ligase. No entanto, fragmentos deste tipo são mais difíceis de se ligarem (a reação de ligação é menos eficiente e mais propensa a falhar) porque não há terminações de fita única para manter as moléculas de DNA na posição.

SAIBA MAIS:

Enzimas de restrição são nomeadas a partir das espécies de procariontes dos quais foram isoladas. Por exemplo, as enzimas isoladas da bactéria Escherichia coli começariam com Eco (como em EcoRI).

Mais de 3, comma000 enzimas de restrição já foram isoladas de uma grande variedade de organismos. Alguns exemplos são mostrados na tabela abaixo:

Nome	Origem	Site de reconhecimento	Padrão de corte
EcoRI	Escherichia coli	$5'-\text{GAATTC} - 3'\\3'-\text{CTTAAG}-3'$	$5'-\text{G}\downarrow \text{AATTC} - 3'\\3'-\text{CTTAA} \uparrow \text{G}-5'$
BamHI	Bacillus amyloliquefaciens	$5'-\text{GGATCC} - 3'\\3'-\text{CCTAGG}-3'$	$5'-\text{G} \downarrow \text{GATCC} - 3'\\3'-\text{CCTAG} \uparrow \text{G}-5'$
HindIII	Haemophilus influenzae	$5' - \text{AAGCTT} - 3\\3' - \text{TTCGAA}-5'$	$5' - \text{A}\downarrow \text {AGCTT} - 3\\3' - \text{TTCGA}\uparrow\text{A}-5'$
SmaI	Serratia marcescens	$5' - \text{CCCGGG} - 3\\3' - \text{GGGCCC}-5'$	$5' - \text{CCC}\downarrow\text{GGG} - 3\\3' - \text{GGG}\uparrow\text{CCC}-5'$
SacI	Streptomyces achromogenes	$5' - \text{GAGCTC} - 3\\3' - \text{CTCGAG}-5'$	$5' - \text{GAGCT} \downarrow \text{C} - 3\\3' - \text{C}\uparrow\text{TCGAG}-5'$

Tabela modificada de "Enodunucleases de restrição comuns," por Fundação CK-12 (CC BY-NC-SA 3.0).

DNA ligase

Se você aprendeu sobre replicação de DNA, você já pode ter encontrado a DNA ligase. Na replicação de DNA, o trabalho das ligases é unir fragmentos de DNA recém sintetizados para formar uma fita sem emenda. As ligases usadas na clonagem de DNA fazem basicamente a mesma coisa. Se dois pedaços de DNA tiverem terminações complementares, a DNA ligase pode juntá-las para fazer uma molécula intacta.

Como a DNA ligase faz isso? Usando o ATP como fonte de energia, a ligase catalisa uma reação em que o grupo fosfato terminal da extremidade 5' de uma fita de DNA é ligado ao grupo hidroxila terminal da extremidade 3' da outra. Esta reação produz um esqueleto intacto de açúcar-fosfato.

Exemplo: construção de um plasmídio recombinante

Vamos ver como a digestão por restrição e a ligação podem ser usadas para inserir um gene em um plasmídeo. Suponha que temos um gene alvo, ladeado com sítios de reconhecimento da EcoRI, e um plasmídeo, contendo um único sítio EcoRI:

Nosso objetivo é usar a enzima EcoRI para inserir o gene no plasmídeo. Primeiro, nós separadamente digerimos (cortamos) o fragmento do gene e o plasmídeo com EcoRI. Este passo produz fragmentos com extremidades adesivas:

Em seguida, pegamos o fragmento de gene e um plasmídeo linearizado (aberto) e os combinamos com a DNA ligase. As extremidades adesivas dos dois fragmentos unem-se por pareamento de bases complementares:

Uma vez que eles foram unidos pela ligase, os fragmentos se tornam um único pedaço de DNA intacto. O gene alvo agora está inserido no plasmídeo, fazendo um plasmídeo recombinante.

Digestões por restrição e ligações envolvem muitas moléculas de DNA

No exemplo acima, nós vimos um resultado de uma ligação entre um gene e um plasmídeo cortado com EcoRI. No entanto, outros resultados poderiam acontecer nesta mesma ligação. Por exemplo, o plasmídeo cortado poderia recircularizar (fechando-se) sem absorver o gene. Da mesma forma, o gene poderia entrar no plasmídeo, mas virado para trás (uma vez que as duas extremidades adesivas da EcoRI são idênticas).

Digestões por restrição e ligações como essa são executadas usando muitas cópias de DNA do plasmídeo e do gene. Na verdade, bilhões de moléculas de DNA são utilizadas em uma única ligação! Estas moléculas colidem aleatoriamente umas com as outras, e com a DNA ligase, em diferentes maneiras. Portanto, se múltiplos produtos podem ser feitos, todos eles serão feitos com alguma frequência – incluindo aqueles que não queremos.

Como podemos evitar plasmídeos "ruins"? Quando nós transformamos bactérias com DNA de uma ligação, cada uma pega um pedaço diferente do DNA. Nós podemos checar as bactérias após a transformação e usar somente as que possuem o plasmídeo correto. Em muitos casos, o plasmídeo de bactérias modificadas é analisado utilizando outra digestão por restrição para ver se ele contém a inserção certa na orientação certa.

Créditos:

Esse artigo é um derivado modificado de "DNA cloning - Advanced," by CK-12 Foundation (CC BY-NC 3.0).

O artigo adaptado está autorizado sob a licença CC BY-NC-SA 4.0

Referências:

Bergmann, D. (2011). Biotechnology. [Course handout] Em BIO41: 2011 Molecular Biology lectures on DNA, RNA, and biotechnology.

Metzenberg, S. (2002). Lecture 5: Restriction endonucleases. Em Recombinant DNA techniques. Disponível em http://escience.ws/b572/L5/L5.htm.

Restriction site. (2015, December 7). Acesso em 31 de março de 2016.Disponível em Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_site.

Restriction endonucleases. (2016). In New England biolabs. Disponível em https://www.neb.com/products/restriction-endonucleases/restriction-endonucleases.

Transformação & seleção bacteriana

Transferência de DNA plasmidial para bactérias. Como as bactérias são selecionadas. Produção e purificação de proteínas.

Pontos Principais:

As bactérias podem incorporar DNA exógeno em um processo denominado transformação.
A transformação é um passo fundamental na clonagem de DNA. Ocorre após clivagem e ligação e transfere plasmídeos recém-criados para bactérias.
Após a transformação, as bactérias são selecionadas em lâminas antibióticas. As bactérias com um plasmídeo são resistentes a antibióticos e cada uma formará uma colônia.
As colônias com o plasmídeo sicerto podem ser cultivadas para formar grandes culturas de bactérias idênticas, que são usadas para produzir plasmídeo ou sintetizar proteína.

Visão geral: clonagem de DNA

A transformação e seleção bacteriana são passos fundamentais na clonagem de DNA. Clonagem de DNA é o processo de fazer muitas cópias de uma parte específica do DNA, como um gene. Frequentemente as cópias são feitas em bactérias.

Em um experimento típico de clonagem, os pesquisadores primeiramente introduzem um pedaço de DNA, como um gene, em um pedaço circular de DNA denominado plasmídeo. Esta etapa utiliza enzimas de restrição e DNA ligase e é denominada ligação.

Após uma ligação, o próximo passo é transferir o DNA para as bactérias, em um processo denominado transformação. Então, podemos usar métodos de seleção de antibióticos e análise de DNA para identificar as bactérias que contém o plasmídeo que procuramos.

Passos da transformação e seleção bacteriana

Este é um procedimento típico de transformação e seleção bacteriana:

Bactérias especialmente preparadas são misturadas com DNA (ex., de uma ligação).
Um choque térmico é dado nas bactérias, o que faz com que algumas delas incorporem um plasmídeo.

SAIBA MAIS:

A resposta básica é que o choque térmico torna a membrana bacteriana mais permeável a moléculas de DNA, como os plasmídeos. Parece que o choque de calor forma poros na membrana bacteriana, através dos quais moléculas de DNA podem passar.

A)	Clone
B)	Híbrida
C)	Mutante.
D)	Adaptada
E)	Transgênica.

A)	liberação de gás carbônico
B)	formação de ácido lático.
C)	formação de água.
D)	produção de ATP.
E)	liberação de calor

1)	as melancias obtidas pelos japoneses são um dos muitos exemplos de plantas transgênicas.
2)	aves como Chester e Fiesta, vendidas comercialmente, são obtidas por meio da transferência de genes.
4)	a seleção artificial não leva ao aparecimento de novas variedades de um animal ou planta.
8)	para a transferência de genes de uma espécie para outra, podem ser utilizados vírus como transportadores dos genes.
16)	comprovadamente, os diferentes tipos de produtos oriundos dos organismos geneticamente modificados trazem sérios riscos à saúde humana.
32)	mutações no DNA, portanto no genoma dos seres vivos, fazem parte do processo da evolução biológica e podem ocorrer em qualquer ser vivo.

A)	a sequência de DNA codificante de insulina humana.
B)	a proteína sintetizada por células humanas.
C)	um RNA recombinante de insulina humana.
D)	o RNA mensageiro de insulina humana.
E)	um cromossomo da espécie humana.

A)	I - II - IV
B)	II - III - IV
C)	III - IV - V
D)	IV - V

A)	O material genético dos vírus é unicamente o DNA;
B)	As células nervosas são diferentes das células musculares porque contêm genes diferentes;
C)	O tipo sanguíneo O é mais frequente e, por esse motivo, o alelo responsável por sua expressão é dominante sobre os demais;
D)	Terapia gênica consiste em substituir o alelo anormal que causa doença pelo alelo normal;
E)	Enzimas de restrição são fundamentais à Engenharia Genética porque permitem a passagem de DNA através da membrana celular.

quinta-feira, 22 de outubro de 2020

Introdução à biotecnologia

Pontos Principais:

Introdução

O que é biotecnologia?

O que é tecnologia do DNA?

Exemplos de tecnologia do DNA

Biotecnologia e novas questões éticas

Eduque-se e compartilhe sua opinião

Referências:

Referências:

Outras referências:

Visão geral: Clonagem de DNA

Pontos Principais:

Introdução

Visão geral da clonagem de DNA

Etapas da clonagem do DNA

1. Cortando e colando DNA

2. Transformação e seleção bacteriana

3. Produção de proteína

Usos da clonagem de DNA

Referências:

Referências:

Outras referências:

Enzimas de restrição e DNA ligase

Pontos Principais:

Como cortar e colar DNA?

Enzimas de restrição

DNA ligase

Exemplo: construção de um plasmídio recombinante

Digestões por restrição e ligações envolvem muitas moléculas de DNA

Créditos:

Referências:

Transformação & seleção bacteriana

Pontos Principais:

Visão geral: clonagem de DNA

Passos da transformação e seleção bacteriana

Por que precisamos verificar as colônias?

Produção de proteína em bactérias

Possibilidade 1: Bactérias = fábricas de plasmídeos

Possibilidade 2: Bactérias = fábricas de proteína

Referências:

Referências:

Outras referências:

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